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本试剂盒可以高效克隆各种PCR产物和任何具有粘性末端的DNA片段。该试剂盒对磷酸化或非磷酸化的DNA片段都有效。阳性选择载体和插入片段连接仅需5min即可获得超过95%的阳性重组克隆。试剂盒中配备了新型的RapiLigation Mix为高效的T4 DNA连接酶反应试剂，其中含有连接增强剂、酶稳定剂，可大大缩短连接时间、提高PCR产物的连接和克隆效率。

• 高效快速：5min快速连接，阳性率近100%。
  
• 灵敏广泛：适合低至0.025pmol浓度片段和长至3kb片段的高效连接。
  
• 操作便捷：配合使用新型RapiLigation Mix，只需加入载体和片段即可进行连接反应。

• 不同片段使用量
  载体与片段的摩尔比控制在1:3～1:8，请根据凝胶电泳或紫外分光光度计检测后的浓度和片段长度来计算其摩尔比。插入片段用量，可根据以下公式粗略计算：
  

  插入片段用量ng = (3～10)×	插入片段长度	×载体用量ng
  	载体长度

  连接体系中50ng的载体，不同大小的PCR产物最佳加入量举例如下：
  

  PCR产物长度(bp)	最佳的使用量(ng)
  700bp	35ng
  2000bp	100ng

• 反应体系
  标准体系为10μL体积，5μL的反应体系也能取得很好的效果，试剂用量减半。

• 1.连接使用的PCR片段3'端应带有A末端，如果是使用pfu等高保真聚合酶扩增的不带A末端的平末端片段，可选用零背景快速克隆试剂盒(货号：WH0191)。
  
• 2.转化过程中使用Control Insert DNA做对照是非常必要的，在实验出现问题时可以确定原因。
  
• 3.建议留下部分连接产物，在出现问题后能迅速的补救，减少不必要的重复实验。
  
• 4.涂布用量可根据具体实验作相应调整。如转化的DNA总量较多，可取更少量转化产物涂布平板；反之，如转化的DNA总量较少，可取200～300μL转化产物涂布平板。如果预计的克隆较少，可通过离心（4000rpm，2min）后吸除部分培养液，留下适量的培养基悬浮菌体后将其涂布于一个平板中（涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的菌液再涂布新的培养板）。

• 按照下表的内容在无菌的离心管中加入各种成分。
  

  成分	用量
  2×RapiLigation Mix	5μL
  pLB-T Vector（50ng/μL）	1μL
  目的PCR片段/Control Insert DNA	X μL/1μL
  ddH2O	至10μL

• 轻轻弹动离心管以混匀内容物，短暂离心3～5sec。将混合反应液置于22℃反应5min。反应结束后，将离心管置于冰上，进行后续的转化反应。
  
  • 如果插入片段长度小于1kb，反应时间可以采用5～10min。
    
  • 如果插入片段长度为1～2kb，反应时间可以采用10～20min。
    
  • 如果插入片段长度大于2kb，反应时间可以采用30min至过夜。
• 转化
  
  • 制备含有氨苄青霉素终浓度100μg/mL的LB琼脂糖平板。将平板放置在37℃，至少预热20min。
    
  • 取部分连接产物加到50～100μL DH5α感受态细胞中（感受态细胞应刚从-90~-65℃冰箱取出放于冰浴上，待刚刚解冻时加入连接产物，连接产物的加入量不超过感受态细胞体积的十分之一），轻弹混匀，冰浴30min（必要时请使用超螺旋质粒pUC19同步转化感受态细胞作为对照检测转化效率，将1μL的Compcell Control Plasmid pUC19加入另一只感受态细胞管中作为对照，其余的操作步骤与连接产物的转化步骤同步进行）。
    
  • 将离心管置于42℃水浴90sec，取出管后立即置于冰浴中放置2～3min，期间不要摇动离心管。
    
  • 向离心管中加入350μL 37℃预热的SOC或LB（不含抗生素）培养基，180rpm、37℃振荡培养45min～60min。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。
    
  • 将离心管中的菌液混匀，吸取200μL加到含氨苄青霉素的LB固体琼脂培养基上，用无菌的弯头玻棒或玻璃珠轻轻的将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12～16h。
• 检测
  
  • 常规检测：将得到的菌落接种1～5mL LB (含有终浓度为50～100μg/mL的氨苄青霉素)培养基，37℃摇床振荡培养过夜，保存菌种后提取质粒，应用PCR或酶切方法鉴定插入片段是否正确。
    
  • 快速检测：挑取菌落直接进行PCR检测(具体方法见分子克隆第三版)。
    
  • 测序鉴定：使用常规或快速方法进行初步的鉴定后进行序列的测定。

• pLB-T Vector测序引物：
  pLB Forward Sequencing Primer (23-mer)：
  5'-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3'
  pLB Reverse Sequencing Primer (24-mer):：
  5'-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3'
  
• pLB-T Vector图谱
  
  
• pLB-T Vector多克隆位点